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伊萊特（活性微礦）抗菌實驗

檢測單位:        河南省農科院畜牧所   

檢測樣品:        伊萊特（活性微礦）   

檢驗類別:          藥敏檢測          

 

報告日期:         2017年8月4日        

伊萊特（復合礦物）檢測實驗

1.實驗日期：2017年7月1日-2017年7月31日

2.送檢單位：韓國龍宮伊萊特株式會社

3.實驗目的:檢測伊萊特（活性微礦）對豬大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）、豬鏈球菌（Streptococcus suis,SS）、豬沙門氏菌（Paratyphoid of  pigs,SC）和豬副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS）的影響，以及對比其他藥物其效果如何。

4.實驗地點：河南省農科院畜牧所

5.實驗員：朱文豪 張青嫻 王治方

6.實驗方法

6.1 實驗材料

伊萊特（活性微礦）由韓國龍宮伊萊特株式會社提供；大腸桿菌、鏈球菌、沙門氏菌及副豬嗜血桿菌由河南省農科院畜牧所提供；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD） 由廣州鼎國生物有限公司提供；乳牛血清購自北京四季青生物試劑有限公司；麥康凱培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）和胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基均購自北京陸橋技術有限公司；DNA 提取試劑盒等購自大連寶生物公司；SS培養(yǎng)基和藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

6. 2 伊萊特（活性微礦）藥敏片的制備

6. 2.1藥敏片的制備：取定性濾紙，用打孔機打成6毫米直徑的圓形小紙片，取圓紙片50片放入清潔干燥的青霉素空瓶中，瓶口以單層牛皮紙包扎，經15磅15-20分鐘高壓消毒后，放在37℃溫箱或烘箱中數天，使完全干燥。

6. 2.2藥液的制備（用于商品藥的試驗）：按伊萊特（活性微礦）改善量0.2-0.3%配制藥液。及1000ml水2-3g藥，配制藥敏片所用的藥液，使每個藥敏片含量達到50ug/片。

6. 2.3抗菌藥紙片制作：在上述含有50片紙片的青霉素瓶內加入藥液適量，并翻動紙片，使各紙片充分浸透藥液，翻動紙片時不能將紙片搗爛。同時在瓶口上記錄藥物名稱，放37℃溫箱內過夜，干燥后即密封，切勿受潮，置陰暗干燥處存放，有效期3-6個月。

6.3 病原菌的復蘇培養(yǎng)

將凍干粉的各個菌種從超低溫冰箱拿出，加1mL無菌生理鹽水混勻之后培養(yǎng)基接種。將大腸桿菌接種在普通瓊脂上或者麥康凱培養(yǎng)基上、鏈球菌接種在TSA 培養(yǎng)基上、沙門氏菌接種在SS培養(yǎng)基上、副豬嗜血桿菌病接種在0.001%NAD 和 5% 乳牛血清的TSA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)。37℃培養(yǎng)24h可見大腸桿菌、鏈球菌、沙門氏菌生長；培養(yǎng)36-48 h可見副豬嗜血桿菌生長。

6.4藥敏試驗

6.4.1劃線接種

在“超凈臺”（或自制無菌操作臺）中，用（酒精燈）經火焰滅菌的接種環(huán)從病料中挑取適量細菌培養(yǎng)物，以劃線方式將細菌涂布到平皿培養(yǎng)基上。具體方式：用滅菌接種環(huán)取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點涂菌，以每點開始劃線涂菌至平皿的1/2，然后找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密布于平皿。（另：可將待試細菌于少量生理鹽水中制成細菌混懸液，將少量混懸液倒入平皿培養(yǎng)基上，輕晃平皿使鋪勻，放置5-10min）。

6.4.2貼藥敏片

將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停，取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)基表面。為了使藥敏片與培養(yǎng)基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片。為了使能準確的觀察結果，要求藥敏片能有規(guī)律的分布于平皿培養(yǎng)基上，一般可在平皿中央貼一片，外周可等距離貼若干片（外周一般可貼4-5片），每種藥敏片的名稱要記住。

6.4.3培養(yǎng)觀察

將平皿培養(yǎng)基倒置放于37℃溫箱中培養(yǎng)24小時以及48h后，觀察效果。

      

7.觀測指標

7.1 藥敏實驗的結果，在涂有細菌的瓊脂平板上，抗菌藥物在瓊脂內向四周擴散，其濃度呈梯度遞減，因此在紙片周圍一定距離內的細菌生長受到抑制。過夜培養(yǎng)后形成一個抑菌圈，抑菌圈越大，說明該菌對此藥敏感性越大，反之越小，若無抑菌圈，則說明該菌對此藥具有耐藥性。其直徑大小與藥物濃度、劃線細菌濃度有直接關系。

7.2  藥物敏感實驗判定標準參考表1，抑菌圈直徑在15mm以上為高敏，10mm以下為低敏，無抑菌圈為不敏。

表1 藥物敏感實驗判定標準

8 實驗結果

表 2　藥敏試驗結果

9. 影響藥敏結果的因素

9.1培養(yǎng)基：應根據試驗菌的營養(yǎng)需要進行配制。傾注平板時，厚度適合（約5-6mm），不可太薄，一般90mm直徑的培養(yǎng)皿，傾注培養(yǎng)基18-20ml為宜。

9.2細菌接種量：細菌接種量應恒定，如果太多，抑菌圈變小。

9.3藥物濃度：藥物的濃度和總量直接影響抑菌試驗的結果，需精確配制。

9.4培養(yǎng)時間：一般培養(yǎng)溫度和時間為37℃、12-24小時。但有些細菌生長緩慢，如副豬嗜血桿菌，要培養(yǎng)36-48h才能生長良好，因此要推遲觀察時間，而得到準確的抑菌圈。

10. 結論

在本實驗中可以看到伊萊特（活性微礦）對大腸桿菌（19mm）、沙門氏菌（22mm）以及副豬嗜血桿菌（23mm）都有顯著的抑菌效果，達到了高敏藥物的效果，而對鏈球菌（4mm）效果不明顯。為何會有這樣的反差呢？分析發(fā)現(xiàn)伊萊特（活性微礦）在抑菌效果上的顯著表現(xiàn)，主要針對G－菌，而對G＋表現(xiàn)為不敏。

在生產中，應選擇高敏藥物進行改善，但有時候藥物的適口性相對較差，伊萊特（活性微礦）作為一種礦物質可以避免這種情況，在給動物預防和改善疾病的時候，通過積極飲食達到好的治改善果。